Ban đầu, Vatican áp đặt các biện pháp trừng phạt nghiêm khắc đối với cha Piô vào những năm 1920 để giảm bớt sự nổi tiếng của ông ấy trong quần chúng: ông bị cấm cử hành Thánh lễ nơi công cộng, cấm ban phép lành cho mọi người, cấm thư từ, cấm để lộ dấu thánh của mình một cách công khai và cấm giao tiếp với cha Benedetto, vị linh hướng của ông.

Tòa Thánh quyết định chuyển cha Piô đến một tu viện khác ở miền bắc nước Ý. Người dân địa phương đe dọa sẽ nổi loạn nếu Vatican thuyên chuyển ông ấy đến nơi khác. Một kế hoạch thuyên chuyển thứ hai cũng đã được tính đến nhưng rồi cũng lại phải thay đổi. Từ năm 1921 đến năm 1922, cha Piô bị tước quyền linh mục của mình, chẳng hạn như không được dâng Thánh lễ và ngồi tòa giải tội. Từ năm 1924 đến năm 1931, Tòa thánh đưa ra các tuyên bố phủ nhận rằng các sự kiện trong cuộc đời của cha Piô là không do bất kỳ nguyên nhân thiêng liêng nào.

Luigi Romanelli, kiểm tra y tế vào năm 1919

Một số lượng lớn các bác sĩ đã đến thăm cha Piô để xác minh xem các dấu thánh là có thật hay không. Người đầu tiên nghiên cứu các vết thương của cha Piô là Luigi Romanelli, bác sĩ trưởng của bệnh viện công lập Barletta, theo lệnh của cha bề trên giám tỉnh, vào ngày 15 và 16 tháng 5 năm 1919. Trong báo cáo của mình, ngoài những điều khác, bác sĩ viết: "Các vết thương trên bàn tay ông ấy được bảo vệ bởi một cái găng tay màu nâu đỏ, không có chảy máu hay sưng hoặc viêm ở các mô xung quanh. Tôi tin chắc rằng các vết thương không chỉ là ở ngoài da. Khi tôi đưa ngón tay cái vào lòng bàn tay của ông ấy và ngón trỏ trên mu bàn tay của ông thì tôi nhận thấy rõ ràng rằng có một lỗ trống ở trong đấy."

Amico Bignami, kiểm tra y tế vào năm 1919

Hai tháng sau, vào ngày 26 tháng 7 năm 1919, nhà nghiên cứu bệnh học Amico Bignami đồng thời cũng là một bác sĩ đến San Giovanni Rotondo. Bignami đã tiến hành kiểm tra y tế với vết thương của cha Piô và đưa ra một số giả thuyết, trong đó có giả thuyết rằng vết thương là một vết hoại tử da do sử dụng các hóa chất như cồn iốt để ngăn việc lành vết thương.

Giorgio Festa, kiểm tra y tế vào năm 1919 và năm 1920

Giorgio Festa là một bác sĩ và là một linh mục dòng Tên, đã khám cho cha Piô vào năm 1919 và năm 1920. Ông ấy đã rất ấn tượng bởi mùi thơm của dấu thánh. Festa, giống như Bignami trước đây, đã mô tả vết thương bên sườn giống như hình chữ thập. Trong báo cáo của mình với Tòa Thánh năm 1925, Festa đã đưa ra một phán quyết đồng tình với dấu thánh và phản đối quan điểm chỉ trích của Gemelli về dấu thánh của cha Piô với các lập luận thần học đóng vai trò chính.

Agostino Gemelli, kiểm tra tâm thần năm 1920 và kiểm tra y tế năm 1925

Năm 1920, cha Agostino Gemelli - một linh mục, một bác sĩ và nhà tâm lý học - được Đức Hồng Y Rafael Merry del Val ủy nhiệm đến thăm cha Piô và tiến hành kiểm tra các vết thương. Với lý do là "đã tự mình đến bán đảo Gargano mà không phải do bất kỳ cơ quan Tòa Thánh nào yêu cầu, Gemelli đã gửi thư riêng tới văn phòng của Tòa Thánh xin cho phép anh gặp và làm một bài báo cáo không chính thức về cha Piô". Gemelli muốn tìm hiểu về vấn đề này và mong muốn gặp mặt vị linh mục ấy. Cha Piô tỏ thái độ khép kín đối với điều tra viên mới này: ông đã từ chối chuyến viếng thăm dù có sự xin phép bằng văn bản của văn phòng Tòa Thánh. Cha Gemelli đã phản đối lời từ chối ấy cho rằng mình có quyền bắt người tu sĩ phải kiểm tra y tế về dấu thánh. Cha Piô được sự hỗ trợ của bề trên dòng, đã đặt điều kiện cho việc kiểm tra y tế là phải có giấy phép được thông qua một cách hệ thống, có thứ tự, được xét duyệt bởi Tòa Thánh mà không tính đến các chứng chỉ về chuyên môn nghề nghiệp của cha Agostino Gemelli. Không thỏa được các điều kiện, Gemelli rời tu viện, bực bội và cảm thấy bị xúc phạm vì không được phép xem xét các dấu thánh. Anh đi đến kết luận rằng Francesco Forgione (tên tục của cha Piô) là "một người có hiểu biết hạn chế, năng lượng tâm linh thấp, suy nghĩ đơn điệu, ý chí thấp". Gemelli đã đánh giá về sự việc này rằng: "Vụ này là một trong những gợi ý do cha Benedetto gieo vào tâm trí yếu ớt của cha Piô một cách vô thức, tạo ra những biểu hiện đặc trưng của chứng psittacism[14] vốn là bản chất của chứng cuồng loạn".

Lần này được Tòa Thánh cho phép, Gemelli đã khám lại cho cha Piô vào năm 1925, viết báo cáo vào tháng 4 năm 1926. Lần này cha Piô đồng ý cho anh ta xem vết thương. Gemelli cho rằng nguyên nhân của các vết thương ấy là do việc sử dụng hóa chất ăn mòn mà cha Piô đã tự bôi lên. Giorgio Festa đã cố gắng đặt câu hỏi chỉ trích về những kết luận của Gemelli về các dấu thánh nói chung. Gemelli đã đáp lại lời chỉ trích này trong bản báo cáo của mình. Ông đã làm rõ những tuyên bố của mình về bản chất vết thương của cha Piô: "Bất kỳ ai có kinh nghiệm về pháp y, và trên hết là xem xét các vết loét và vết thương mà những người lính đã tự gây ra cho bản thân trong chiến tranh, đều có thể chắc chắn rằng đây là những vết thương do sự ăn mòn gây nên bởi hóa chất. Bề mặt của vết loét và hình dạng của nó về mọi mặt đều giống với vết loét được quan sát thấy ở những người lính đã tự gây ra cho mình".

Một lần nữa, Gemelli đánh giá sức khỏe tâm thần của cha Piô là hạn chế: "Ông ấy (cha Piô) là đối tác lý tưởng mà cha Benedetto, một cựu Giám tỉnh, có thể tạo ra một cặp incubus-succubus (hai con quỷ trong truyền thuyết phương Tây). Ông ấy là một linh mục tốt: điềm tĩnh, kiệm lời, nhã nhặn, đức hạnh hơn là sự yếu kém về sức khỏe tâm thần. Một linh hồn tội nghiệp có thể lặp đi lặp lại một vài thuật ngữ tôn giáo khuôn mẫu. Một người đàn ông tội nghiệp, ốm yếu đã học được những lời dạy từ chủ nhân của mình là cha Benedetto". Gemelli đã viết vào năm 1940 và sau đó đã gửi nhiều lần cho văn phòng của Tòa Thánh về điều mà ông coi là những tuyên bố phi lý đối với những điều về cha Piô.

Raffaele Rossi và cuộc điều tra giáo luật năm 1921

Giám mục ở Volterra là Raffaele Rossi dòng Cát Minh Chân Phước (tiếng Latinh: Ordo Carmelitarum Discalceatorum) được Tòa Thánh chính thức ủy nhiệm vào ngày 11 tháng 6 năm 1921 để thực hiện một cuộc điều tra giáo luật liên quan đến cha Piô. Rossi bắt đầu chuyến đi của mình vào ngày 14 tháng 6 tại San Giovanni Rotondo bắt đầu với việc thẩm vấn các nhân chứng gồm hai linh mục và bảy thầy tu. Sau tám ngày điều tra, cuối cùng ông đã hoàn thành một bài báo cáo và gửi đến Tòa Thánh vào ngày 4 tháng 10 năm 1921, lễ Thánh Phanxicô Assisi. Bản báo cáo về cơ bản nêu rõ như sau: Cha Piô, là vị linh mục mà Rossi có ấn tượng tốt, là một mục tử nhiệt thành và tu viện San Giovanni Rotondo là một cộng đoàn tốt đẹp; dấu thánh là không thể giải thích được nhưng chắc chắn đấy không phải là tác phẩm của ma quỷ hay một hành động lừa dối hoặc gian lận trắng trợn nào; chúng cũng không phải là mánh khóe của một kẻ quỷ quyệt và hiểm độc. Trong các cuộc phỏng vấn với các nhân chứng mà Rossi đã thực hiện tổng cộng ba lần, vị giám mục đã được chứng kiến dấu thánh của cha Piô lúc đó ông 34 tuổi. Rossi coi những dấu thánh này là một "sự thật có thật".

Trong các ghi chú của mình được ghi trực tiếp trên giấy và trong bài báo cáo, Rossi mô tả hình dạng và sự xuất hiện của các vết thương trong bàn tay là "rất rõ ràng". Những vết ở bàn chân thì đã "biến mất". Những gì có thể quan sát được là hai điểm nhô cao trên bàn chân với làn da trắng và mềm. Đối với vết thương trên ngực: "Ở bên cạnh sườn anh ta, dấu thánh được thấy là một đốm hình tam giác, màu rượu vang đỏ, còn những đốm nhỏ khác thì không còn nữa, tiếp đó là một vết hình chữ thập lộn ngược như cái được nhìn thấy vào năm 1919 bởi tiến sĩ Bignami và tiến sĩ Festa". Cha Rossi cũng yêu cầu Tòa Thánh hãy tham khảo ý kiến ​​​​của cha Piô viết một tiểu sử về ông ấy, Rossi cũng đang tập hợp các thông tin từ cha Benedetto và các tài liệu mà anh ta đã thu thập được để một ngày nào đó anh ấy có thể viết một cuốn sách về cuộc đời của cha Piô.

Theo cha Rossi, "Trong số những trường hợp chữa bệnh đã được báo cáo, nhiều trường hợp chưa được xác nhận hoặc không tồn tại. Tuy nhiên, trong các thư từ của cha Piô, có một số tuyên bố đáng tin cậy cho rằng phép lạ là do sự can thiệp của ông. Nhưng nếu không có xác nhận y tế thì rất khó để đưa ra kết luận và vấn đề vẫn còn đang bỏ ngỏ". Theo Lucia Ceci, một nhà sử học, cha Rossi đã không thể tìm thấy bất kỳ phép lạ nào được gán cho cha Piô.

Khi Rossi hỏi cha Piô về việc ông ấy có thể phân thân, cha Piô trả lời: "Tôi không biết nó như thế nào hoặc bản chất của hiện tượng này là gì - và chắc chắn là tôi không nghĩ gì nhiều lắm - nhưng nó đã xảy ra với tôi khi tôi đứng trước mặt người này hay người kia, ở nơi này hay nơi kia; tôi không biết liệu tâm trí của tôi đã được di chuyển đến đó hay những gì tôi nhìn thấy là một hình thức nào đó của nơi chốn hoặc con người; tôi không biết biết liệu tâm trí của tôi có ở đó với cơ thể của tôi hay không".

Giáo hoàng Gioan XXIII, các cuộc điều tra và băng ghi âm sau năm 1958

Giáo hoàng Gioan XXIII hoài nghi về cha Piô. Khi bắt đầu nhiệm kỳ của mình, ông biết rằng những người chống đối cha Piô đã đặt các thiết bị nghe lén trong phòng ngủ và tòa giải tội của tu viện, ghi âm lại những lời nói của ông ấy. Bên ngoài nhật ký bán chính thức của mình, Đức Giáo hoàng Gioan XXIII đã viết trên bốn tờ giấy rằng ông ấy cầu nguyện cho "PP" (viết tắt của Padre Pio) và việc điều tra thông qua các cuộn băng, nếu những gì chúng ngụ ý là đúng về các mối quan hệ thân thiết và không đứng đắn của ông ấy với những người phụ nữ từ đội cận vệ bất khả xâm phạm xung quanh ông ta đã chỉ ra một tai họa khủng khiếp cho người dân. Bản thân Đức Giáo hoàng Gioan XXIII có lẽ chưa bao giờ nghe những cuốn băng, nhưng cho rằng quan điểm này là đúng đắn: “Lý do giúp tôi có được sự thanh thản về tinh thần, đó là một đặc ân và ân sủng vô giá, là vì cá nhân tôi cảm thấy trong sạch khỏi sự ô nhiễm mà trong bốn mươi năm qua đã ăn mòn hàng trăm ngàn linh hồn khiến họ trở nên ngu ngốc và loạn trí ở mức độ chưa từng thấy". Theo Sergio Luzzatto, tác giả cuốn sách Padre Pio: Miracles and Politics in a Secular Age (tạm dịch: Padre Pio: Phép lạ và Chính trị trong thời đại thế tục), Vatican đã không ra lệnh cho việc nghe lén này. Trong một ghi chú nhật ký khác, Đức Giáo hoàng Gioan XXIII đã viết rằng ông muốn hành động. Trên thực tế, ông ấy đã ra lệnh cho một cuộc điều tra giáo luật khác.

Carlo Maccari và cuộc điều tra giáo luật lần thứ hai năm 1960

Cha Carlo Maccari là một tổng thư ký của Tòa Thánh Rôma và ông ấy đã gặp cha Piô tổng cộng chín lần. Có một sự không tin tưởng lẫn nhau giữa cha Piô và cha Maccari, Maccari đã viết trong nhật ký của mình: "Sự kín đáo, đầu óc hẹp hòi, dối trá - đây là những vũ khí mà anh ta sử dụng để trốn tránh các câu hỏi của tôi... Cảm tưởng chung: thật đáng thương". Maccari đòi cha Piô bỏ việc "hôn" sau khi xưng tội cho các chị em giáo dân. Maccari có ghi nhận trong báo cáo của mình rằng cha Piô không được giáo dục tôn giáo đầy đủ. Anh ấy làm việc rất nhiều. Anh ta không phải là một người sống khổ hạnh và có nhiều mối liên hệ với thế tục bên ngoài, nói chung có quá nhiều sự pha trộn giữa cái “thiêng liêng” và cái “trần tục”. Trong báo cáo của mình, Maccari đã ghi tên những người phụ nữ tiết lộ mình là người tình của cha Piô vào thời điểm đó, nhưng không đánh giá tính xác thực của những tuyên bố này. Maccari tập trung vào việc đánh giá sự cuồng tín của cha Piô ảnh hưởng lên công đồng, mô tả đó là "những quan niệm tôn giáo dao động giữa mê tín và ma thuật". Maccari gọi những người ủng hộ cha Piô là "một tổ chức rộng lớn và nguy hại". Cha Piô chưa bao giờ được những tín đồ khuyên là nên tiết chế lại. Maccari tự hỏi thể nào mà Chúa lại có thể cho phép "rất nhiều sự dối trá" diễn ra như thế.

Maccari kết thúc báo cáo quan trọng của mình với một danh sách các khuyến nghị tiếp tục đối phó với cha Piô. Các thầy tu của tu viện Đức Mẹ Ban Ơn nên dần được thuyên chuyển sang nơi khác và cử một tu viện trưởng mới đến quản lý. Không ai được phép xưng tội với cha Piô hơn một lần mỗi tháng. Bệnh viện đã được trao các quy chế mới để cắt đứt trách nhiệm của các thầy dòng Capuchin là "chữa bệnh" về mặt y tế và tinh thần. Sau chuyến đi của Maccari, Đức Giáo hoàng Gioan XXIII đã ghi trong nhật ký của mình rằng ông coi cha Piô như một "thần tượng rơm" (tiếng Ý: idolo di stoppa).